cDNA-AFLP (cDNA amplified fragment length polymorphism)技术是Bachem等(1996)在AFLP技术的基础上发展起来的一种能使差异表达基因可视化的新技术(洛克沃斯基和卡伦, 2008)。该技术不仅保留了AFLP技术的多态性丰富、无需了解序列信息、稳定性高等优点，还具有重复性好、假阳性低、能快速稳定地获取大量基因表达信息等特点(Bachem et al., 1996; 1998; Money et al., 1996)，并能对生物体转录组进行全面系统的分析，目前已成为筛选差异表达基因最有效的方法之一，广泛应用于小麦(赵继荣等, 2009)、玉米(吴敏生等, 2001)、马铃薯(郭军等, 2004)、茶树(余梅等, 2007)、胡杨(马洪双等, 2010)、杨树(吴丽丽等, 2011)和白桦(刘雪梅等, 2012)等多种植物研究。

油茶(Camellia oleifera Abel.)是中国特产的木本油料树种，与油棕、油橄榄、椰子并称为世界四大木本油料植物(庄瑞林等, 2008, 中国林业出版社, pp.1-58; 彭方仁, 2007, 中国林业出版社, pp.306-312)。它具有适应性强、分布广、寿命长、产量高等特性(庄瑞林等, 2008, 中国林业出版社, pp.1-58)。由油茶种子榨取的茶油素有“东方橄榄油”之美誉，营养成份丰富，不饱和脂肪酸含量达90%以上，是中国特有的优质食用油(何方等, 1997; 廖书娟等, 2005)。近年来，随着分子生物技术的广泛应用，已有大量涉及油茶分子生物学研究的文献报道，但未见有关油茶cDNA-AFLP体系建立的报道。本文以小果油茶(C. meiocarpa)和普通油茶(C. oleifera)为材料，对油茶不同组织的RNA提取方法以及cDNA-AFLP体系的各个环节进行系统研究，旨在建立适合油茶研究的cDNA-AFLP分析体系，为后续油茶相关差异表达基因筛选及克隆研究提供基础。

1结果与分析
1.1油茶总RNA的质量
由图1可见，用EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒和Trizol试剂盒分别提取油茶嫩叶和种仁总RNA的效果较好，加样孔中没有明显的亮带，28S和18S rRNA条带清晰，溴酚蓝前面的5S条带很弱(甚至有时看不见)，OD₂₆₀/OD₂₈₀比值测定结果也均在1.9~2.0之间，说明提取的总RNA纯度较高，没有明显的降解，完整性好，可用于后续的mRNA分离及反转录反应。

图1 油茶嫩叶总RNA (A)和种仁(B)总RNA 注: 1,2,5,6: 小果油茶; 3,4,7,8: 普通油茶 Figure 1 Total RNA from tender leaf (A) and kernel (B) of Camellia oleifera Note: 1,2,5,6: Camellia meiocarpa; 3,4,7,8: Camellia oleifera

1.2 cDNA酶切及预扩增结果
从图2A可看出，采用37℃双酶切1 h、2 h、3 h、4 h、5 h和6 h均可将小果油茶dsDNA切开，酶切片断集中在100~600 bp，其中37℃水浴5 h的酶切相对较充分，能够得到浓度合适、大小适宜的谱带，因此确定酶切时间以5 h为宜。由不同酶切连接产物用量的预扩增结果(图2B)可知，当连接产物稀释5倍时，扩增信号较弱；连接产物稀释20和30倍时，预扩产物量较少，且片段集中在150~350 bp之间；而将连接产物稀释10倍和15倍进行预扩增，有较强的cDNA弥散带，其片段集中在150~700 bp范围内，但连接产物稀释10倍的预扩增产物更宽、信号更强，因此应选择将连接产物稀释10倍作为预扩增的模板。

图2 不同酶切时间和连接产物稀释倍数的预扩增结果 注: M: 100 bp DNA ladder marker; 1~6 (A): 酶切1~6 h; 1~5 (B): 连接产物稀释5, 10, 15, 20, 30倍 Figure 2 The pre-amplifying with double-stranded cDNA digested by EcoRⅠ/MseⅠ for different time and template product diluted differently Note: M: 100 bp DNA ladder marker; 1~6 (A): EcoRⅠ/MseⅠ digested for 1~6 h; 1~5 (B): The template product diluted 5 times, 10 times, 15 times, 20 times, 30 times each

1.3选择性扩增结果
图3是选择性扩增各参数优化试验的结果。由图3A可看出：模板预扩增产物浓度对PCR扩增的条带数量及质量有较大影响，当预扩产物稀释到50倍时，选择性扩增的条带较弱，稀释倍数为5、10和20倍时，条带片段却较为集中，不能达到选择扩增模板量的要求；而稀释30倍扩增的弥散带信号较强，片段集中在100~500 bp之间呈上下弥散，因此可选稀释30倍作为选择性扩增反应的模板。dNTP (10 mmol/L)取1.5 μL时，选择性扩增效果最佳(图3B)。当引物(10 μmol/L)分别取0.5 μL时，条带弥散，但信号偏弱；当引物(10 μmol/L)分别取2.0和2.5 μL时，扩增条带片段较为集中，扩增效果差；当引物(10 μmol/L)分别取1.0 μL和1.5 μL时，条带弥散且信号强(图3C)，故可取1.0 μL或1.5 μL的引物(10 μmol/L)进行选择性扩增。当Taq酶用量分别为0.5 U、0.75 U和1.0 U/20 μL时，选择性扩增效果较差，而当用量为1.25 U和1.5 U时，扩增的弥散带相对较宽，均可作为选择性扩增的浓度，但考虑到成本应选择1.25 U/ 20 μL的Taq酶进行选择性扩增(图3D)。

图3 不同模板(A), dNTP (B), 引物(C)和Taq酶(D)用量对选择性扩增的影响 注: M: 100 bp DNA ladder marker; A中1~5分别为模板稀释50, 30, 20, 10和5倍; B中1~5分别为dNTP (10 mmol/L)取0.5~2.5 μL, 梯度为0.5; C中1~5分别为引物(10 μmol/L)取0.5~2.5 μL, 梯度为0.5; D中1~5分别为Taq酶用量从0.5~ 1.5 U/20 μL，梯度为0.25 Figure 3 The effect of the different content of template (A), dNTP (B), primer (C) and Taq enzyme (D) on selective amplification Notes: M: 100 bp DNA ladder marker; A, 1~5: The template diluted 50 times, 30 times, 20 times, 10 times, 5 times each; B, 1~5: The dNTP (10 mmol/L) content from 0.5 to 2.5 μL, and concentration gradient was 0.5 μL; C, 1~5: The primer (10 μmol/L) content from 0.5 to 2.5 μL, and concentration gradient was 0.5 μL；D, 1~5: The Taq enzyme content from 0.5 U to 1.5 U in 20 μL selective amplification system, and the gradient was 0.25 U

1.4引物筛选结果
用上述优化的选择性扩增体系，对14条E-NN(N)和15条M-NN(N)引物组成的210对引物组合进行选择扩增筛选，共筛选出扩增条带数目在15条以上的引物组合有148对(表1)，其中扩增重复性好且条带数目在20以上的引物组合有61对，图4为部分引物组合的扩增结果。

表1 不同引物组合的扩增结果 Table 1 AFLP fragment number amplified by different primer combination

图4 部分引物对在小果油茶种仁中的扩增结果 Figure 4 The selective amplified result with some pairs in kernel of Camellia meiocarpa

1.5差异条带回收及PCR检测
将E-ACA/M-CAC引物组合扩增产生的差异片段进行回收，并将回收片段进行扩增(图5)。由图5可知，选择性扩增的产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、回收及再扩增后能获得条差异带，说明本试验所建立的油茶cDNA-AFLP分析体系是成功的。

图5 从聚丙烯酰胺凝胶上回收的差异片段PCR扩增结果 Figure 5 The PCR result with different gene fragment as the template

2讨论
差异显示方法是鉴定未知基因的主要手段之一(马洪双等, 2010)。cDNA-AFLP技术是研究基因差异表达最直接有效的方法，已成为基因差异表达显示、表达基因遗传连锁作图和基于表型克隆基因的常用方法(祝军等, 2010)，目前已被广泛应用于多种植物生长发育过程中差异基因分离与表达特性研究，但未见在油茶上利用该技术进行相关研究的报道。

cDNA-AFLP技术程序多且繁琐，涉及到RNA提取、mRNA分离、双链cDNA合成、cDNA酶切、接头连接、预扩增、选择性扩增和聚丙烯凝胶电泳等，其指纹图谱在描述基因表达的忠实性上依赖于每一步操作步骤的累积(洛克沃斯基和卡伦, 2008)，任何一步的疏忽均会影响到后续的试验结果，因此每一步操作都必须严格谨慎。首先，总RNA和mRNA的纯度及完整性是油茶cDNA-AFLP分析能否顺利完成的关键。由于不同植物不同组织所含的内含物不同，本研究采用EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒和Trizol试剂盒均可从小果油茶和普通油茶嫩叶和种仁组织中分离到完整无损、纯度高的总RNA，为双链cDNA的合成及其后续步骤提供基础。其次，双链cDNA的完全酶切是油茶基因组表达序列多态性得以检测的根本保证。本研究选用EcoRⅠ/MseⅠ酶切组合的酶切结果比较理想，说明EcoRⅠ/MseⅠ酶切体系能将油茶cDNA充分酶切。在cDNA-AFLP体系中，预扩增和选择性扩增反应在整个试验中起着决定性的作用，连接产物稀释10倍直接用于预扩增，以预扩增产物稀释30倍为模版、dNTP (10 mmol/L) 1.5 μL、引物 (10 μmol/L) 1.0 μL、Taq酶用量1.25 U时的选择性扩增效果较好。应用本研究建立的油茶cDNA-AFLP技术体系，对210对引物组合进行筛选，共筛选出扩增重复性好且条带数目在20以上的引物组合有61对，可用于油茶cDNA-AFLP研究。选择性扩增的部分产物经电泳、银染、差异片段回收及PCR检测，能得到带纹清晰、扩增信号强的差异条带，说明本研究优化后的cDNA-AFLP分析体系适用于油茶相关基因差异表达研究，为筛选油茶相关基因的功能研究奠定基础。

3材料与方法
3.1材料
材料来源于中国林科院亚热带林业研究所油茶物种园，野外采集小果油茶和普通油茶的嫩叶和种仁，快速投入液氮中冷冻，带回实验室进行RNA提取。

3.2总RNA提取及双链cDNA的合成与纯化
用艾德莱公司的EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒提取油茶嫩叶总RNA，用invitrogen公司的Trizol试剂盒提取油茶籽种仁总RNA，操作步骤按说明书规定进行。用Promega公司的PolyATtract^® mRNA Isolation Systems试剂盒分离mRNA，用TaKaRa公司的M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit试剂盒合成双链cDNA。

3.3双链cDNA的酶切与连接
选用EcoRⅠ/MseⅠ酶(New England Biolabs, USA)对合成的cDNA进行双酶切，反应体系为模板双链cDNA 1.0 μg，10×NEBuffer EcoRⅠ 2.0 μL，100×BSA 0.2 μL，EcoRⅠ 0.5 μL，MseⅠ 0.5 μL，补灭菌去离子水至20 μL。上述操作均在冰上进行，充分混匀后于37℃酶切反应，酶切时间设1 h、2 h、3 h、4 h、5 h和6 h共6个处理，65℃温育20 min终止反应。

cDNA酶切产物用T₄ DNA连接酶(New England Biolabs, USA)连接。EcoRⅠ和MseⅠ接头(表2)的设计及预处理参照Bachem等(1998)的方法进行。连接体系为：cDNA酶切产物16 μL，T4 DNA ligase Buffer 2.0 μL，EcoRⅠ接头(5 μmol/L) 0.5 μL，MseⅠ接头(50 μmol/L) 0.5 μL，T4连接酶(5 U/μL) 1 μL，总体积20 μL。短暂离心，连接体系16℃温育6~16 h，65℃灭活10 min。

表2 cDNA-AFLP接头和引物核苷酸序列 Table 2 cDNA-AFLP adapters and primer nucleotide sequences

3.4预扩增与选择性扩增
采用EcoRⅠ E₀₀+MseⅠ M₀₀引物组合进行预扩增。预扩增体系：cDNA酶切连接产物(初级模板)设稀释5、10、15、20和30倍5个处理，10×PCR Bu- ffer 5.0 μL，dNTPs (10 mmol/L) 2.0 μL，EcoRⅠ E₀₀ (10 μmol/L) 1.0 μL，MseⅠ M₀₀ (10 μmol/L) 1.0 μL，Taq酶(5 U/μL) 0.2 μL，补灭菌去离子水至20 μL。PCR扩增程序：94℃ 3 min，(94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 1 min)×35循环，72℃ 10 min，4℃保存。取5 μL产物于1.2%琼脂糖凝胶上电泳检测。

选择性扩增PCR反应条件优化参照Bachem等(1998)方法，对PCR扩增的模板、dNTP、引物和Taq酶的用量等逐一进行筛选，扩增体系筛选均用E-AG、M-GG引物对进行，反应体系20 μL，模板的优化梯度是预扩增产物稀释5、10、20、30和50倍，其它体系不变；dNTPs浓度的优化梯度是dNTPs (10 mmol/L)取0.5 μL、1.0 μL、1.5 μL、2.0 μL和2.5 μL；引物浓度的优化梯度是E-AG (10 μmol/L)、M-GG (10 μmol/L)分别取0.5 μL、1.0 μL、1.5 μL、2.0 μL和2.5 μL；Taq酶用量的优化梯度是20 μL体系中含Taq酶0.5 U、0.75 U、1.0 U、1.25 U和1.5 U。PCR扩增程序为：94℃ 3 min，(94℃ 30 s, 65℃ 30 s (每循环温度递减0.7℃)，72℃ 60 s)×12个循环；(94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 60 s)×24个循环，72℃ 10 min，4℃保存。选择性扩增的产物用1.5%琼脂糖电泳检测。

3.5引物筛选
用上述优化的选择性扩增体系，对210对引物组合(表1)进行选择扩增筛选，以油茶嫩叶和种仁为底物，通过6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行了筛选。

3.6差异片段的回收
用解剖刀割下目的凝胶条带，放入已灭菌的0.2 mL PCR管中，加入30~60 μL无菌ddH₂O，用无菌牙签捣碎，100℃水浴10 min后，立即置于冰上，12 000 rpm离心10 min，取上清10 μL作模板，进行PCR扩增，扩增引物与选择性扩增相同，扩增程序同预扩增程序，扩增体系为：模板5.0 μL，10×PCR Buffer 5.0 μL，dNTPs (10 mmol/L) 4.0 μL，E-ACA (10 μmol/L) 2.0 μL，M-CAC (10 μmol/L) 2.0 μL，Taq酶(5 U/μL) 0.4 μL，补灭菌去离子水至50 μL。扩增产物用1.2%琼脂糖进行检测。

作者贡献
谢一青、黄勇和卓仁英是本研究的实验设计和实验研究的执行人，并完成论文初稿的写作；李志真参与试验数据分析；姚小华是项目的构思者和负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家科技支撑项目(2009BADB1B01)、福建省科技厅项目(2009R10008-5)、福建省林木种苗科技攻关项目(闽林科(2013)1号)、国家林业局南方山地用材林培育重点实验室和福建省森林培育与林产品加工利用重点实验室共同资助。

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